PCR, или полимеразна верижна реакция, е сложна лабораторна техника, която се използва широко в медицината и други научни области. PCR диагностиката по едно време се превърна в истински пробив в науката.
Описание
Количествената PCR е вид PCR в реално време.
Това се разбира като вариант на PCR, при който кинетиката на реакцията се записва постоянно, което дава възможност да се оцени качествено съдържанието на специфични ДНК нуклеотидни последователности в сложна молекулна смес.
Количественият PCR метод ще бъде обсъден по-подробно по-долу.
Същността на анализа
Културните и серологични методи се използват особено често за диагностициране на инфекции. При първия се определят антитела срещу инфекциозен патоген в кръвния серум. Във втория биологичен материал, взет от болен човек, се използва за засяване на специфична среда, която е благоприятна за растежа на колонии от патогени. Диагностика и в дветеслучаят може да продължи дни или седмици.
PCR изследването може да се извърши с различни биологични материали, получени от болен човек. Като проби действат кръв и други патологични, физиологични и биологични среди и течности. Можете да направите PCR изпражнения или урина.
Атипичните и вирусни инфекции най-често се диагностицират чрез количествен PCR, тъй като може да не са лесни за диагностициране поради специфичния характер на провокирания от тях патологични процеси. За определяне на такива инфекции е необходимо време, през което в тялото започват да се произвеждат антитела, определени чрез серологични методи. Но това е неприемливо в някои случаи.
Метод на извършване
PCR метод - лабораторно откриване на инфекция в проби, изолирани от пациента (in vitro).
За провеждане на полимеразна верижна реакция е необходим набор от специални реагенти.
Изследваният материал се въвежда в епруветки с реактиви. Епруветките се поставят в специален апарат - PCR усилвател, който е предназначен да амплифицира (увеличава броя) на желаните РНК или ДНК фрагменти, PCR усилвателят работи в цикличен режим. При всеки цикъл, ако пробите съдържат РНК или ДНК последователността на патогена, тогава в разтвора се натрупват все повече и повече копия на частиците на тези нуклеинови киселини. Можете да определите наличието на патогена и неговото количество в пробите.
Видове PCR
Качественият анализ чрез PCR ви позволява да получите следния резултат:
- отрицателен, когато патогенът, който представлява интерес, не е открит в пробите;
- положителен, ако в пробите са открити последователности, които са характерни за конкретен патоген.
С положителен PCR резултат можем да говорим с 95% точност за наличието на диагностицирана инфекция. В същото време точността на PCR комплектите, използвани за диагностични цели, достига 100%.
Обикновено 5% от неверните резултати се определят от човешкия фактор. Например, нарушенията на техниката за анализ и съхранение на реагенти могат значително да намалят точността на изследването.
Количествената PCR дефинира концепцията за вирусен товар. Възможно е да се определи колко набора ДНК на патогена са били в пробите, взети от пациента.
Тежестта на инфекцията е право пропорционална на увеличаването на техния брой. Можете също така да определите успеха на терапията за намаляване на вирусния товар.
Подаване за PCR биоматериал
Количествена PCR се извършва в клиниката, предимно сутрин. По време на посещение при лекаря на пациента ще бъде казано какво трябва да се вземе: остъргване, намазки, урина или кръв. PCR може да открие патогени, независимо от нивото на замърсяване на материала.
За положителен анализ на теория е необходимо наличието само на един патоген в пробите. На практика се опитват да създадат още по-благоприятни условия. Има някои препоръки за това:
- ако вземат остъргване или тампон от гениталиитеоргани, трябва да се въздържате от интимен контакт три дни преди изследването;
- не можете да се измивате с антибактериални лекарства или да се миете преди анализа;
- три часа преди да вземете намазка от уретрата, трябва да сте търпеливи и да не изпразвате червата си.
Не спазвайте тези правила, когато дарявате кръв.
Как се интерпретират резултатите от количествения PCR анализ?
Количествена оценка на получените резултати
В редица клинични ситуации се появява проблемът за ефективността на лечението и/или динамиката на патологичния процес. Такива въпроси са особено актуални при изследване на хора с хронични инфекции (вирус на човешкия имунодефицит, хепатит В и С). При диагностицирането те се основават на факта, че натрупването на ампликони (PCR продукти) е пропорционално на наличието на копия на желания ген в анализираната проба.
Разбира се, като се вземат предвид резултатите от количествената PCR се извършва чрез гел електрофореза с изследване на интензитета на специални PCR сигнали. Също така, предпоставка за правилна количествена оценка на получените резултати са положителните надеждни контролни проби, съдържащи известен брой копия на желания ген (например хиляда копия на гена на хепатит С за една PCR реакция). Няколко серийни разреждания на количествения контрол позволяват да се генерират калибровъчни криви и се използват за оценка на съдържанието на клинични генокопи в клинични проби.
В дефиницията за количествен PCR ключово постижение е създаванетофлуоресцентни ДНК сонди, които се добавят към реакционната смес едновременно с прости праймери и ви позволяват да проследявате PCR процеса във времето, тоест PCR в реално време.
Методологията на TaqMan се отнася до синтеза на флуоресцентни ДНК сонди, които са специфични за средната част на ампликона и имат два етикета в краищата. Единият от тях е флуоресцентен етикет, вторият е гасителна молекула за тази флуоресценция.
Специално устройство, което е хибрид от флуориметър и термоблок-усилвател, прави постоянни измервания на флуоресценцията във всяка епруветка (принцип PCR в реално време). След 20-40 цикъла на PCR ще бъдат получени отделни криви за всяка проба. Броят на копията на желания ген, който се съдържа в тестовата проба, може да бъде изчислен от калибровъчните криви с контролни проби.
Също така, важна характеристика на прилагането на PCR чрез флуоресцентния метод е, че няма нужда да се отварят епруветки с PCR смес, когато се вземат предвид резултатите. Това намалява възможността от замърсяване на помещението с продукти за усилване и не е необходимо да се разпределят специални работни зони за електрофореза.
Какво показва количествен PCR транскрипт?
Какво се открива?
Чрез метод като количествен PCR се откриват качествени промени в гените: вмъквания, делеции и точкови мутации. Но при някои наследствени заболявания съответните симптоми се появяват в отговор на промяна в съдържанието на определени гени.
БлагодаряКоличественият анализ дава числен резултат, най-често в IU / ml. Това означава, че в един милилитър от тестовата проба е открит определен брой копия на РНК или ДНК на патогена, измерени в международни единици.
В зависимост от мащаба се диагностицира тежестта на инфекцията. Кръвта обикновено се изследва за определяне на вирусния товар, тъй като вирусите се движат свободно в кръвта по време на заболяване.
Функции
Количественият PCR в кръвен тест има две характеристики.
- Анализът се извършва в присъствието на праймери или дезоксирибонуклеозидни трифосфати, които са маркирани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, за да се определи точно съдържанието на образувания PCR продукт.
- В процеса на PCR прекратете реакцията по-рано, преди да се появят твърде много PCR продукти. Това се дължи на факта, че в крайния етап на насищане, когато има много PCR продукти, както самият ензим, така и субстратите действат като ограничаващи връзки на тази реакция. Краят на следващия PCR цикъл при такива условия вече не се характеризира с удвояване на броя на PCR продуктите, изравняват се незначителни количествени разлики между различните проби, които са доста ясно дефинирани в ранните етапи след преминаване през серия от реакционни цикли.
Цена за PCR диагностика
PCR изследването има цена, която зависи от това какъв вид инфекция ще бъде тествана, от методологията на анализа и от тестовия материал. За да определите една инфекция, ще трябва да се поддадете200-800 рубли. Добавя се и такса за вземане на биоматериал - приблизително 400 рубли.
