Рекомбинантната ДНК са молекули, образувани чрез лабораторни техники за генетична рекомбинация за комбиниране на генетичен материал от множество източници. Възможно е, защото ДНК молекулите на всички организми имат една и съща химическа структура и се различават само по нуклеотидната последователност в нея.
Създаване
Молекулното клониране е лабораторен процес, използван за създаване на рекомбинантна ДНК. Това е един от двата най-широко използвани метода, заедно с полимеразната верижна реакция (PCR). Позволява ви да контролирате репликацията на всяка конкретна ДНК последователност, избрана от експериментатора.
Има две фундаментални разлики между методите за рекомбинантна ДНК. Едното е, че молекулярното клониране включва репликация в жива клетка, докато PCR включва in vitro. Друга разлика е, че първият метод позволява изрязване и поставяне на ДНК последователности, докато вторият се подобрява чрез копиране на съществуващия ред.
Векторна ДНК
Получаването на рекомбинантна ДНК изисква клониращ вектор. Той се получава от плазмиди или вируси и е сравнително малък сегмент. Изборът на вектор за молекулярно клониране зависи от избора на организма гостоприемник, размера на ДНК, която ще бъде клонирана, и дали чуждите молекули трябва да бъдат експресирани. Сегментите могат да се комбинират с помощта на различни методи като клониране на рестрикционен ензим/лигаза или сглобяване на Гибсън.
Клониране
В стандартните протоколи клонирането включва седем стъпки.
- Изберете гостоприемник и вектор за клониране.
- Получаване на ДНК вектор.
- Образуване на клонирана ДНК.
- Създаване на рекомбинантна ДНК.
- Въвеждане в организма на гостоприемника.
- Избор на организми, които го съдържат.
- Избор на клонинги с желани ДНК вложки и биологични свойства.
След трансплантация в организма гостоприемник, чуждите молекули, съдържащи се в рекомбинантната конструкция, могат или не могат да бъдат експресирани. Експресията изисква преструктуриране на гена, за да включва последователности, които са необходими за производството на ДНК. Използва се от машината за превод на хоста.
Как работи
Рекомбинантната ДНК работи, когато клетката гостоприемник експресира протеин от рекомбинантни гени. Експресията зависи от заобикалянето на гена с набор от сигнали, които предоставят инструкции за неговата транскрипция. Те включват промотор, рибозомно свързване и терминатор.
Проблеми възникват, ако генсъдържа интрони или сигнали, които действат като терминатори за бактериалния гостоприемник. Това води до преждевременно прекратяване. Рекомбинантният протеин може да бъде неправилно обработен, нагънат или разграден. Производството му в еукариотните системи обикновено се случва при дрожди и нишковидни гъби. Използването на клетки за животни е трудно поради необходимостта от здрава поддържаща повърхност за много хора.
Свойства на организмите
Организмите, съдържащи рекомбинантни ДНК молекули, имат очевидно нормални фенотипове. Техният външен вид, поведение и метаболизъм обикновено не се променят. Единственият начин да се демонстрира наличието на рекомбинантни последователности е да се изследва самата ДНК с помощта на теста за полимеразна верижна реакция.
В някои случаи рекомбинантната ДНК може да има вредни ефекти. Това може да се случи, когато неговият фрагмент, съдържащ активен промотор, е разположен до преди това тих ген на клетката гостоприемник.
Използвайте
Рекомбинантната ДНК технология се използва широко в биотехнологиите, медицината и научните изследвания. Неговите протеини и други продукти могат да бъдат намерени в почти всяка западна аптека, ветеринарна клиника, лекарски кабинет, медицинска или биологична лаборатория.
Най-често срещаното приложение е в фундаменталните изследвания, където технологията е от съществено значение за голяма част от днешната работа в биологичните и биомедицинските науки. Рекомбинантната ДНК се използва за идентифициране, картиране и последователност на гени и за определянето имфункции. rDNA сондите се използват за анализиране на генната експресия в отделни клетки и в тъкани на цели организми. Рекомбинантните протеини се използват като реагенти в лабораторни експерименти. Някои конкретни примери са дадени по-долу.
Рекомбинантен химозин
Намерен в сирена, химозинът е ензим, необходим за направата на сирене. Това беше първата генетично модифицирана хранителна добавка, използвана в индустрията. Микробиологично произведен рекомбинантен ензим, структурно идентичен с ензим, получен от телета, е по-евтин и се произвежда в по-големи количества.
Рекомбинантен човешки инсулин
Практически заместен инсулин, получен от животински източници (напр. прасета и говеда) за лечение на инсулинозависим диабет. Рекомбинантният инсулин се синтезира чрез въвеждане на човешкия инсулинов ген в бактерии от рода Eterichia или дрожди.
Хормон на растежа
Преписва се на пациенти, чиято хипофизна жлеза не произвежда достатъчно хормон на растежа, за да поддържа нормалното развитие. Преди да стане наличен рекомбинантният хормон на растежа, той се получава от хипофизната жлеза на трупове. Тази опасна практика е накарала някои пациенти да развият болест на Кройцфелд-Якоб.
Рекомбинантен коагулационен фактор
Това е кръвосъсирващ протеин, който се прилага на пациенти с форми на хемофилия с нарушения на кръвосъсирването. Те не могат да произвеждатфактор VIII в достатъчни количества. Преди разработването на рекомбинантен фактор VIII, протеинът е произведен чрез обработка на големи количества човешка кръв от множество донори. Това носи много висок риск от предаване на инфекциозни заболявания.
Диагностика на ХИВ инфекция
Всеки от трите широко използвани метода за диагностициране на HIV инфекцията е разработен с помощта на рекомбинантна ДНК. Тест за антитела използва нейния протеин. Той открива наличието на ХИВ генетичен материал с помощта на полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция. Разработването на теста стана възможно чрез молекулярно клониране и секвениране на ХИВ геномите.
