Хроматографията е един от методите за разделяне на вещества. Използва се за последващ качествен и количествен анализ на физичните и химичните свойства на микрочастиците. Разновидност на тази технология е афинитетна хроматография. Идеята за диференциране на протеинови съединения с помощта на свойството на молекулярния афинитет е известна в науката от няколко десетилетия. Въпреки това, той получи своето развитие едва през последните години, след въвеждането на високопорьозни хидрофилни материали, използвани като матрица. Този метод позволява решаване както на аналитични проблеми (разделяне на веществата и тяхното идентифициране), така и на подготвителни проблеми (пречистване, концентрация).
Есенция
Афинитетна хроматография (от латинската дума affinis - „съседен”, „свързан”) се основава на афинитетни взаимодействия, които представляват образуването на високоспецифични връзки между спейсър молекула (лиганд или афинант) и целева молекула. Тези механизми са широко разпространени в природата (свързване на медиатори или хормони и рецептори, антитела иантигени, хибридизация на полинуклеотиди и други видове процеси). В медицината афинитетната хроматография се използва за практически цели от 1951 г.
Компонентите са разделени, както следва:
- работният разтвор, съдържащ веществото, което трябва да се изолира, се прекарва през сорбента;
- лиганд, депозиран върху сорбентната матрица, запазва това вещество;
- е концентриран (натрупване);
- екстракция на изолираното вещество от сорбента чрез промиване с разтворител.
Този метод ви позволява да изолирате цели клетки. Разликата от традиционната сорбционна хроматография е, че има силно биоспецифично свързване на изолирания компонент със сорбента, което се характеризира с висока селективност.
Адсорбенти
Следните вещества се използват като адсорбенти:
- Гелови съединения на базата на агароза, полизахарид, получен от агар. Най-често използваните са 3 разновидности: сефароза 4В, CL (омрежена агароза) и афи-гел. Последният състав е модифициран гел от агароза и полиакриламид. Има по-голяма биологична инертност, висока химическа и термична устойчивост.
- Силициев диоксид (силикагел).
- Стъкло.
- Органични полимери.
За да се премахнат механичните пречки по време на контакт с лиганда, се използват допълнителни вещества за отделянето му от носителя (пептиди, диамини, полиамини, олигозахариди).
Оборудване
Оборудването за афинитетна хроматография включва следните основни единици:
- резервоари за съхранение на мобилната фаза (елуент);
- помпи за високо налягане за средно захранване (най-често бутални);
- филтър за почистване на елуенти от прах;
- дозиращо устройство;
- хроматографска колона за разделяне на сместа;
- детектор за откриване на отделени компоненти, напускащи колоната;
- записващи устройства за хроматограма и микропроцесорен блок (компютър).
За да се намали количеството на разтворения въздух, хелият първо преминава през подвижната фаза. За промяна на концентрацията на елуента са инсталирани няколко помпи, управлявани от програмиста. Хроматографските колони са изработени от неръждаема стомана (за повишени изисквания за устойчивост на корозия), стъкло (универсална опция) или акрил. За подготвителни цели диаметърът им може да варира от 2 до 70 см. При аналитичната хроматография се използват микроколони Ø10-150 µm.
За да се повиши чувствителността на детекторите, в сместа се въвеждат реагенти, които допринасят за образуването на вещества, които абсорбират повече лъчи в ултравиолетовата или видимата област на спектъра..
Методология
Има 2 основни типа течна афинитетна хроматография:
- Колона, в която колоната се запълва с неподвижна фаза и през нея се пропуска смес с потокелуент. Разделянето може да се случи под налягане или под гравитация.
- Тънък слой. Елюентът се движи по плоския адсорбентен слой под въздействието на капилярни сили. Адсорбентът се нанася върху стъклена плоча, керамичен или кварцов прът, метално фолио.
Основните етапи на работа включват:
- приготвяне на адсорбента, фиксиране на лиганда върху носителя;
- подаване на разделителната смес към хроматографската колона;
- зареждане на мобилна фаза, свързване на компонент от лиганд;
- замяна на фаза за изолиране на свързаното вещество.
Дестинация
Афинитетна хроматография се използва за изолиране на следните видове вещества (видът на използвания лиганд е посочен в скоби):
- аналози на ензимни инхибитори, субстрати и кофактори (ензими);
- биоорганични вещества с признаци на генетична чуждост, вируси и клетки (антитела);
- въглехидрати с високо молекулно тегло, монозахаридни полимери, гликопротеини (лектини);
- ядрени протеини, нуклеотидилтрансферази (нуклеинови киселини);
- рецептори, транспортни протеини (витамини, хормони);
- протеини, взаимодействащи с клетъчните мембрани (клетки).
Тази технология се използва и за получаване на имобилизирани ензими и свързването им с целулоза позволява производството на имуносорбенти.
Хроматография на ДНК-свързващи протеини
Изолирането на ДНК-свързващи протеини се извършва с помощта нахепарин. Този гликозаминогликан е способен да свързва широк спектър от молекули. Афинитетна хроматография на протеини от тази група се използва за изолиране на вещества като:
- фактори на иницииране и удължаване на транслацията (синтез на молекули на нуклеинова киселина и протеини);
- рестриктази (ензими, които разпознават определени последователности в двуверижна ДНК);
- ДНК лигази и полимерази (ензими, които катализират свързването на две молекули за образуване на нова химическа връзка и участват в репликацията на ДНК);
- серинови протеазни инхибитори, които играят важна роля в имунните и възпалителни процеси;
- растежни фактори: фибробласт, Schwann, ендотелен;
- протеини от извънклетъчен матрикс;
- хормонални рецептори;
- липопротеини.
Достойнство
Този метод е един от най-специфичните за изолиране на реактивни съединения (ензими и по-големи агрегати - вируси). Въпреки това, той се използва не само за изолиране на биологично активни вещества.
Откриване на антитела в малки количества, количествена оценка на полиадениловата киселина, бързо определяне на молекулните маси на дехидрогеназите, отстраняване на някои замърсители, изследване на кинетиката на активиране на неактивната форма на трипсин, молекулярната структура на човека интерферони - това не е целият списък от изследвания, в които се използва афинитет хроматография. Използването в клиниката се дължи на нейните предимства като:
- Ефективна способност за почистванепротеини, полизахариди, нуклеинови киселини. Те се различават леко по своите физични и химични свойства и губят активност по време на хидролиза, денатурация и други видове третиране, използвани при други методи.
- Скоростта на разделяне на веществата, динамичната природа на процеса.
- Няма нужда от специално ензимно пречистване и изоензимна хомогенизация за определяне на константите на дисоциация.
- Може да отделя широк спектър от вещества.
- Ниска консумация на лиганди.
- Възможност за разделяне на вещества в големи обеми.
- Обратим процес на свързване на биологични макромолекули.
Тази техника може да се комбинира с други, за налагане на допълнително поле (гравитационно, електромагнитно). Това ви позволява да разширите техническите възможности на хроматографията.
Ензимно инженерство
Благодарение на този метод започна активното развитие на нов клон на биотехнологията - ензимното инженерство.
Афинитетна хроматография за изолиране на ензими има следните предимства:
- получаване на ензими в големи количества в резултат на по-малко време, в резултат - намаляването им на цената;
- имобилизирането на ензимите може значително да разшири обхвата на тяхното приложение в медицината и индустрията;
- Свързването на ензими с неразтворима твърда подложка дава възможност да се изследва влиянието на микросредата и посоката на реакциите, които играят важна роля в естествените и физиологични процеси.
