Проточната цитометрия е цитологичен метод за изследване, използван за задълбочен анализ на клетките. Предимството му е, че ви позволява да изучавате всяка клетка поотделно. Този тип анализ помага да се оценят няколко параметъра в стотици клетки за броени секунди. В резултат на това цитофлуориметрията се счита за един от най-бързите и точни методи за анализ, които в момента са достъпни за учени и клиницисти.
Принцип
Принципът на поточната цитометрия се основава на измерването на разсейването на светлината и луминесценцията (флуоресценцията) на клетките. Клетъчната суспензия се пропуска като поток с висока скорост през клетката на цитометъра, където се облъчва с лазер. Там се извършва и така нареченото хидродинамично фокусиране. Механизмът му е, че потокът от клетката с изследваните частици на изхода се влива във външната струя, която има по-висока скорост. В резултат на това частиците са подредени в подредена верига.
Пре-клетките са етикетирани със специални флуоресцентни багрила (флуорохроми). Благодарение на тях, лазерният лъчвъзбужда вторичен блясък. Получените светлинни сигнали се регистрират от детектори. Впоследствие информацията се обработва с помощта на софтуерни алгоритми, които ви позволяват да преброите отделни клетъчни популации, които се различават по някои критерии.
Изследването с конвенционална микроскопия често не успява да направи разлика между различните клетки, защото изглеждат еднакво. Цитофлуориметрията може да предостави други данни (целостта на ДНК структурата), да анализира експресията на протеини, оцеляването на клетките.
Тъй като възбуждането на флуорохроми изисква светлинни лъчи с различни дължини на вълната, както и различни видове детектори, съвременните инсталации са оборудвани с няколко канала за откриване (от 4 до 30). Броят на лазерните излъчватели може да бъде от 1 до 7. По-сложните устройства позволяват многопараметрични изследвания на няколко свойства на частици наведнъж.
Предимства и недостатъци
Предимствата на поточната цитометрия включват:
- висока скорост на обработка (регистрация на до 30 хиляди събития за 1 секунда);
- възможност за изследване на голям брой клетки (до 100 милиона в проба);
- Количествено определяне на интензитета на флуоресцентната светлина;
- анализ на всяка клетка;
- едновременно изследване на хетерогенни процеси;
- автоматично разделяне на данните по клетъчни популации;
- качествена визуализация на резултатите.
Друга характеристика на тази технология е товаанализираната частица може да бъде оцветена с няколко флуоресцентни разтвора. Благодарение на това се получава многопараметрично изследване.
Недостатъците включват сложността на техническото оборудване и необходимостта от специална подготовка на пробата.
Цитометри
Първите устройства от този тип се появяват още през 1968 г. в Германия, но те се разпространяват много по-късно. В момента всички устройства, които работят по метода на поточната цитометрия, могат да бъдат разделени на 2 типа:
- устройства, които измерват флуоресцентно излъчване (две или повече дължини на вълната), 10° и 90° разсейване на светлината (детектор за нисък ъгъл и странично разсейване);
- устройства, които освен че измерват няколко клетъчни параметъра, автоматично се сортират в групи според тези критерии.
Детекторът за разсейване напред е проектиран да определя размера на клетката, а устройството за странично разсейване ви позволява да получите информация за наличието на вътреклетъчни гранули, обемното съотношение на цитоплазмата и ядрото.
Класическите цитометри, за разлика от светлинните микроскопи, не позволяват да се получи изображение на клетка. Въпреки това през последните години бяха разработени комбинирани устройства, които са в състояние да комбинират възможностите на микроскоп и цитофлуориметър. Те ще бъдат обсъдени по-долу.
Цитометри за изображения
За инструменти, използвани в класическата поточна цитометрия,една особеност е характерна: ако в популацията от анализирани клетки се регистрират редки събития, тогава няма как да се прецени каква е тяхната същност. Тези частици могат да бъдат или останки от мъртви клетки, или рядка група от тях. При конвенционалните устройства такива данни са изключени от общия поток от събития, но именно те могат да бъдат от особена стойност за научен и клиничен анализ.
Новото поколение проточни цитометри за изобразяване ви позволява да заснемете изображение на всяка клетка, преминаваща в потока през зоната на детектора. Лесно е да го видите, като кликнете върху съответната област на диаграмата, която се показва на монитора на компютъра.
Области на приложение
Проточната цитометрия е универсален метод, който се използва в много области на медицината и науката:
- имунология;
- онкология;
- трансплантология (трансплантация на червен костен мозък, стволови клетки);
- хематология;
- токсикология;
- биохимия (измерване на киселинността вътре в клетката, изследване на други параметри);
- фармакология (създаване на нови лекарства);
- микробиология;
- паразитология и вирусология;
- океанология (изучаване на фитопланктона за оценка на състоянието на водните тела и други задачи);
- нанотехнология и анализ на микрочастици.
Имунология
Човешката имунна система се състои от голямо разнообразие от клетки. Проточната цитометрия в имунологията дава възможност да се оценят тяхната структура и функции, тоест да се извършват морфофункционалнианализ.
Такова изследване помага да се разбере сложната природа на имунитета. Клетъчните фенотипове се променят в резултат на активиране от антигени, развитие на патологии и други фактори. Цитофлуорометрията може да раздели субпопулации от имунни клетки в сложна смес и да оцени всичките им промени във времето.
Онкология
Една от най-важните задачи в онкологията е диференцирането на клетките според техния тип. Принципът на анализ чрез поточна цитометрия в онкохематологията се основава на следния феномен: когато пробата се третира със специално флуоресцентно багрило, тя се свързва с цитоплазмените протеини. След разделяне в активно пролифериращи клетки съдържанието му намалява наполовина. Съответно, интензивността на клетъчната луминесценция намалява два пъти.
Има и други начини за откриване на пролифериращи клетки:
- използване на ДНК-свързващи багрила (пропидиев йодид);
- използване на етикетиран урацил;
- регистриране на повишено ниво на експресия на циклиновите протеини, които участват в регулирането на клетъчния цикъл.
