За установяване на качествения състав на много хранителни продукти се използва ксантопротеиновата реакция за протеин. Наличието на ароматни аминокиселини в съединението ще даде положителна промяна на цвета на тестовата проба.
Какво е протеин
Нарича се още протеин, който е строителен материал за жив организъм. Протеините поддържат мускулния обем, възстановяват наранени и мъртви тъканни структури на различни органи, независимо дали става дума за коса, кожа или връзки. С тяхно участие се произвеждат червени кръвни клетки, регулира се нормалното функциониране на много хормони и клетки на имунната система.
Това е сложна молекула, която е полипептид с маса по-голяма от 6103 далтона. Белтъчната структура се формира от аминокиселинни остатъци в големи количества, свързани с пептидна връзка.
Протеинова структура
Отличителна черта на тези вещества в сравнение с нискомолекулните пептиди е тяхната развита пространствена триизмерна структура, подкрепена от влияния от различнистепен на привличане. Протеините имат четиристепенна структура. Всеки от тях има свои собствени характеристики.
Основната организация на техните молекули се основава на аминокиселинната последователност, чиято структура се разпознава от ксантопротеиновата реакция към протеина. Такава структура е периодично повтаряща се пептидна връзка -HN-CH-CO-, а радикалите на страничната верига в аминокарбоксилните киселини са селективната част. Те са тези, които определят свойствата на веществото като цяло в бъдеще.
Първичната протеинова структура се счита за достатъчно силна, това се дължи на наличието на силни ковалентни взаимодействия в пептидните връзки. Образуването на следващите нива става в зависимост от признаците, установени в началния етап.
Образуването на вторична структура е възможно поради усукването на аминокиселинната последователност в спирала, в която се установяват водородни връзки между завоите.
Третичното ниво на организация на молекулата се формира, когато една част от спиралата се наслагва върху други фрагменти с появата на всякакви връзки между тях, с водородно, дисулфидно, ковалентно или йонно съединение. Резултатът е асоциации под формата на глобули.
Пространственото подреждане на третичните структури с образуването на химични връзки между тях води до образуването на крайната форма на молекулата или кватернерното ниво.
Аминокиселини
Те определят химичните свойства на протеините. Има около 20 основни аминокиселини,включени в състава на полипептидите в различни последователности. Това също включва редки аминокарбоксилни киселини под формата на хидроксипролин и хидроксилизин, които са производни на основни пептиди.
Като знак за ксантопротеиновата реакция на разпознаване на протеини, наличието на отделни аминокиселини дава промяна в цвета на реагентите, което предполага наличието на специфични структури в техния състав.
Както се оказа, всички те са карбоксилни киселини, в които водородният атом е заменен с аминогрупа.
Пример за структурата на молекула е структурната формула на глицин (HNH− HCH− COOH) като най-простата аминокиселина.
В този случай един от водородите CH2- въглерод може да бъде заменен с по-дълъг радикал, включително бензенов пръстен, амино, сулфо, карбокси групи.
Какво означава ксантопротеиновата реакция
За качествен протеинов анализ се използват различни методи. Те включват реакции:
- биурет с лилав цвят;
- нинхидрин за образуване на синьо-виолетов разтвор;
- формалдехид с червено оцветяване;
- Фолио със сиво-черна седиментация.
При провеждане на всеки метод се доказва наличието на протеини и наличието на определена функционална група в тяхната молекула.
Има ксантопротеинова реакция към протеина. Нарича се още тестът на Мълдър. Отнася се до цветни реакции върху протеини, вкоито са ароматни и хетероциклични аминокиселини.
Особенност на такъв тест е процесът на нитриране на циклични аминокиселинни остатъци с азотна киселина, по-специално добавянето на нитро група към бензоловия пръстен.
Резултатът от този процес е образуването на нитросъединение, което се утаява. Това е основният признак на ксантопротеинова реакция.
Какви аминокиселини се определят
Не всички аминокарбоксилни киселини могат да бъдат открити с този тест. Основната характеристика на ксантопротеиновата реакция на разпознаване на протеин е наличието на бензенов пръстен или хетероцикъл в аминокиселинната молекула.
От протеинови аминокарбоксилни киселини се изолират две ароматни киселини, в които има фенилова група (в фенилаланина) и хидроксифенилов радикал (в тирозина).
Ксантопротеиновата реакция се използва за определяне на хетероцикличната аминокиселина триптофан, която има ароматно индолно ядро. Наличието на горните съединения в протеина дава характерна промяна на цвета на тестовата среда.
Какви реагенти се използват
За да извършите ксантопротеиновата реакция, ще трябва да приготвите 1% разтвор на яйчен или растителен протеин.
Обикновено използвайте пилешко яйце, което се разбива, за да отделите допълнително протеина от жълтъка. За да се получи разтвор, 1% протеин се разрежда в десетократно количество пречистена вода. След разтваряне на протеина, получената течност трябва да се филтрира през няколко слоя марля. Този разтвор трябва да се съхранява на хладно място.
Можете да осъществите реакцията с растителен протеин. За приготвяне на разтвора се използва пшенично брашно в количество от 0,04 кг. Добавете 0,16 l пречистена вода. Съставките се смесват в колба, която се поставя за 24 часа на хладно място с температура около + 1 ° C. След един ден разтворът се разклаща, след което се филтрира първо с памучна вата, а след това с хартиен нагънат филтър. Получената течност се съхранява на хладно място. В такъв разтвор има предимно албуминова фракция.
За провеждане на ксантопротеиновата реакция се използва концентрирана азотна киселина като основен реагент. Допълнителни реагенти са разтвор на 10% натриев хидроксид или амоняк, разтвор на желатин и неконцентриран фенол.
Методология
В чиста епруветка добавете 1% разтвор на яйчен протеин или брашно в количество от 2 ml. Към него се добавят около 9 капки концентрирана азотна киселина, за да спре изпадането на люспите. Получената смес се нагрява, в резултат на което утайката пожълтява и постепенно изчезва, а цветът й преминава в разтвор.
Когато течността изстине, към епруветката по стената се добавят около 9 капки концентриран натриев хидроксид, което е излишък за процеса. Реакцията на средата става алкална. Съдържанието в тубата става оранжево.
Функции
Тъй като ксантопротеинът се нарича качествена реакция към протеини подпод действието на азотна киселина, тогава тестът се извършва под включения димоотвод. Спазвайте всички мерки за безопасност при работа с концентрирани каустични вещества.
По време на процеса на нагряване съдържанието на тръбата може да бъде изхвърлено, което трябва да се има предвид при фиксирането й в държача и избора на наклон.
Приемането на концентрирана азотна киселина и натриев хидроксид трябва да става само със стъклена пипета и гумена крушка, забранено е да се пише с уста.
Сравнителна реакция с фенол
За да се илюстрира процеса и да се потвърди наличието на фениловата група, подобен тест се провежда с хидроксибензен.
Внесете 2 ml разреден фенол в епруветка, след което постепенно, по протежение на стената, добавете 2 ml концентрирана азотна киселина. Разтворът се подлага на нагряване, в резултат на което пожълтява. Тази реакция е качествена за наличието на бензенов пръстен.
Процесът на нитриране на хидроксибензен с азотна киселина е придружен от образуването на смес от паранитрофенол и ортонитрофенол в процентно съотношение 15 към 35.
Сравнение на желатин
За да се докаже, че реакцията на ксантопротеин към протеин открива само аминокиселини с ароматна структура, се използват протеини, които нямат фенолна група.
В чиста епруветка се въвежда 1% разтвор на желатин в количество от 2 ml. Към него се добавят около 9 капки концентрирана азотна киселина. Получената смес се загрява. Разтворът не пожълтява, което доказва липсатааминокиселини с ароматна структура. Понякога се наблюдава леко пожълтяване на средата поради наличието на протеинови примеси.
Химически уравнения
Ксантопротеиновата реакция към протеините протича на два етапа. Формулата на първия етап описва процеса на нитриране на молекула на аминокиселина с помощта на концентрирана азотна киселина.
Пример е добавянето на нитро група към тирозина за образуване на нитротирозин и динитротирозин. В първия случай един NO2-радикал е прикрепен към бензоловия пръстен, а във втория случай два водородни атома са заменени с NO2. Химическата формула на ксантопротеиновата реакция е представена от взаимодействието на тирозин с азотна киселина за образуване на нитротирозинова молекула.
Процесът на нитриране е придружен от преход на безцветен цвят към жълт тон. При провеждане на подобна реакция с протеини, съдържащи аминокиселинни остатъци от триптофан или фенилаланин, цветът на разтвора също се променя.
На втория етап продуктите от нитрирането на тирозиновата молекула, по-специално нитротирозин, взаимодействат с амониев или натриев хидроксид. Резултатът е натриева или амониева сол, която е жълто-оранжева на цвят. Тази реакция е свързана със способността на нитротирозиновата молекула да преминава в хиноидна форма. По-късно от нея се образува сол на нитронната киселина, която има хинонова система от двойно конюгирани връзки.
Така завършва ксантопротеиновата реакция към протеините. Уравнение второетап е представен по-горе.
Резултати
По време на анализа на течности, съдържащи се в три епруветки, разреденият фенол служи като референтен разтвор. Веществата с бензенов пръстен дават качествена реакция с азотна киселина. В резултат на това цветът на разтвора се променя.
Както знаете, желатинът включва колаген в хидролизирана форма. Този протеин не съдържа ароматни аминокарбоксилни киселини. При взаимодействие с киселина няма промяна в цвета на средата.
В третата епруветка се наблюдава положителна реакция на ксантопротеин към протеини. Изводът може да се направи по следния начин: всички протеини с ароматна структура, било то фенилова група или индолов пръстен, променят цвета на разтвора. Това се дължи на образуването на жълти нитро съединения.
Провеждането на цветна реакция доказва наличието на различни химични структури в аминокиселините и протеините. Примерът с желатин показва, че съдържа аминокарбоксилни киселини, които нямат фенилова група или циклична структура.
Ксантопротеиновата реакция може да обясни пожълтяването на кожата, когато върху нея се приложи силна азотна киселина. Млечната пяна ще придобие същия цвят, когато се извърши такъв анализ с нея.
В медицинската лабораторна практика тази цветна проба не се използва за откриване на протеин в урината. Това се дължи на жълтия цвят на самата урина.
Ксантопротеиновата реакция се използва все по-често за количествено определяне на аминокиселини като триптофан и тирозин в различни протеини.
